ヒトＴｈ１７細胞の選択的分化、同定および調節

专利摘要:
ヒトＴｈ１７細胞の分化および活性の両方の調節のための実施形態が提供される。より具体的には、ヒトＴＨ１７細胞分化は、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストによって調節され得る。ＴＨ１７細胞の機能は、例えば、ＢＬＴ１もしくはポドプラニン、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストによって調節され得る。さらに、ＴＨ１７細胞の同定のための実施形態が提供される。より具体的には、ヒトＴＨ１７細胞は、ＢＬＴ１およびポドプラニンを特異的にアップレギュレートする。
公开号:JP2011509676A
申请号:JP2010543306
申请日:2009-01-21
公开日:2011-03-31
发明作者:デイビッド；イー． アンダーソン，；モハメド オウッカ，；ビジェイ；ケー． クヘロー，；デイビッド ハフラー，；エステル ベッテリー，
申请人:ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド；
IPC主号:C12N5-0783

专利说明:

[0001] （連邦政府の資金援助の説明）
本発明は、部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって与えられた助成金第Ｐ０１ ＮＳ０３８０３７号、第ＮＳ０４５９３７号および第３０８４３号の下での政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。]
[0002] （関連特許出願）
この出願は、２００８年１月１８日に出願された米国特許出願第６１／００６，５４１号および２００８年２月２７日に出願された米国特許出願第６１／０３１，８２４号に関連し、これらからの優先権の利益を主張する。]
背景技術

[0003] （背景）
自己免疫疾患（このうちの８０個より多くは、既に同定されている）は、顕著な病的状態および障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）を引き起こし、よく知られているように、診断するのが困難である。２４００万人程度の米国人が、自己免疫疾患に罹患しており、処置費用は、年間１０００億ドルを超えている。]
[0004] 近年、エフェクター細胞の新たな集団であるＴＨ１７細胞が同定され、種々の免疫関連状態において影響を与えていた。これら細胞の発見は、Ｔｈ１／Ｔｈ２パラダイムによって容易には説明されない免疫プロセスの理解に大きな影響を有した。重要なことには、ＴＨ１７細胞は、ヒト自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、および乾癬が挙げられる）の病理と関連した。]
[0005] 齧歯類モデルと関連して、ヒト細胞におけるＴＨ１７細胞の分化、増殖、および機能のさらなる理解、およびＴＨ１７細胞を特異的に同定するための方法は、未だに、自己免疫疾患および他のヒト疾患の探査における重要なゴールである。]
課題を解決するための手段

[0006] （要旨）
本発明の実施形態は、ヒトＴＨ１７細胞の分化を提供する。より具体的には、本発明は、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−１７Ａ分泌の調節の理解をさらに正確にしかつ拡げ、ヒトＴＨ１７細胞分化に必要とされる条件を定義する。]
[0007] 一実施形態において、本発明は、ヒトナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞の集団からのヒトＴＨ１７細胞の分化を、上記Ｔ細胞と、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１とを、ヒトＴＨ１７細胞分化を増大させるに十分な量において接触させることによって、増大させるための方法を提供する。]
[0008] 別の実施形態は、ヒトナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−１７の発現のレベルを、上記細胞と、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１とを、ＩＬ−１７発現を増大させるに十分な量において接触させることによって調節するための方法を提供する。]
[0009] さらに別の実施形態は、ＴＨ１７細胞活性および／もしくはＴＨ１７細胞数を、ＴＨ１７分化が所望される細胞（Ｔ細胞）もしくは細胞集団を（必要に応じて）同定し、上記細胞もしくは細胞集団と、ＴＧＦ−βアゴニストおよびＩＬ−２１アゴニストとを、ＴＨ１７細胞への分化を増大させるために十分な量において接触させ、それによって、ＴＨ１７細胞活性および／もしくは細胞数を増大させることによって増大させるための方法を提供する。]
[0010] 本発明はまた、ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団への前駆Ｔ細胞もしくは前駆Ｔ細胞集団分化を、上記Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団と、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストとを、もしくはＴＧＦ−βＲおよびＩＬ−２１Ｒとを、ＴＨ１７細胞分化を阻害するために十分な量において接触させることによって阻害するための方法を提供する。]
[0011] 代替の実施形態は、Ｔ細胞もしくはＴＨ１７細胞、またはこれらの細胞集団におけるＩＬ−１７の活性、発現、分泌もしくはプロセシングのうちの１つ以上を調節するための方法を提供し、この方法は、ＩＬ−１７の活性もしくはレベルの調節（増大もしくは減少）が所望される細胞を（必要に応じて）同定し；そして上記細胞もしくは細胞集団と、ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のアゴニストもしくはアンタゴニスト）とを、上記細胞もしくは細胞集団におけるＩＬ−１７の活性もしくはレベルを調節するために十分な量において接触させることによって提供される。]
[0012] 例えば、ＴＨ１７細胞の移動活性は、Ｕ７５−３０２（Ｔｈ１７特異的ロイコトリエンＢ４のアンタゴニスト）によって阻害され得る。同様に、ＴＨ１７細胞の移動活性は、ポドプラニンによって阻害され得る。]
[0013] 本発明はまた、ＴＨ１７細胞を同定するための、ならびにＴＨ１７関連自己免疫疾患を診断および／もしくはモニターするための、組成物、方法およびキットを提供する。より具体的には、本発明は、ＴＨ１７細胞において特異的にアップレギュレートされる表面分子を同定する。本発明の一局面において、上記分子は、ロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｅｉｎｅ）Ｂ４（ＬＴＢＲ４（ＢＬＴ１ともいわれる））のレセプターである。別の局面において、上記分子は、ポドプラニンである。]
[0014] 本発明はまたナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞の集団からのヒトＴＨ１７細胞の分化を増大させるための、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１もしくはこれらのアゴニストの使用に関する。]
[0015] 本発明はまた、ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団へのＴ細胞もしくはＴ細胞集団の分化を阻害するための、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストの使用に関する。]
[0016] 本発明はまた、Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団におけるＩＬ−１７の発現、活性、分泌もしくはプロセシングを増大させるための、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１もしくはこれらのアゴニストの使用に関する。]
[0017] 本発明はまた、Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団におけるＩＬ−１７の発現、活性、分泌もしくはプロセシングを減少させるための、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストの使用に関する。]
[0018] 本発明はまた、ＴＨ１７細胞活性によって影響を受けるもしくは媒介される障害の処置のための医薬の調製における、ＴＧＦ−βのアゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストの使用に関する。]
図面の簡単な説明

[0019] 図１ａ〜１ｃは、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１がナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＴＨ１７分化を促進することを示すデータを提示する。図１ａは、ナイーブ（ＣＤ４＋ ＣＤ２５− ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡｈｉ）Ｔヘルパー細胞もしくは中心的記憶（Ｔｃｍ）（ＣＤ４＋ ＣＤ２５− ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔヘルパー細胞について富化した集団へとソートした、健康な被験体の末梢血から得られたＣＤ４＋ Ｔ細胞を示す。
図１ａ〜１ｃは、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１がナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＴＨ１７分化を促進することを示すデータを提示する。図１ｂは、示したサイトカインの存在下で７日間にわたって刺激した、ソートしたＴ細胞集団を示す。その時点で上清を回収し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７Ａについて、ＥＬＩＳＡによって評価した。エラーバーは、３名の関連しない被験体に由来するＴ細胞を使用する３回の独立した実験の中での標準偏差を示す。ＴＧＦ−βとＩＬ−２１との組み合わせによるＩＬ−１７Ａ分泌の誘導は、非常に顕著である（ｐ＜０．０１）。
図１ａ〜１ｃは、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１がナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＴＨ１７分化を促進することを示すデータを提示する。図１ｃは、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１の存在下もしくは非存在下で７日間にわたって刺激したナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞を示す。この時点で、細胞を洗浄し、ＰＭＡ／イオノマイシンで５時間にわたって刺激し、ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの細胞内発現について染色した。比較結果を、５名の関連しないドナーにおいて得た。
図２ａ〜２ｃは、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１が、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞においてＲＯＲＣ２を誘導することを実証する。図２ａは、示されたサイトカインの存在下で７日間にわたって刺激した健康な被験体の末梢血から得られたナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞を示す。その時点で、ＲＮＡを回収し、ＲＯＲＣ２、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−２３Ｒ、およびＦｏｘＰ３のレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。３名の関連しない被験体に由来するＴ細胞を使用する３回の独立した実験の間の平均倍数誘導（外因性サイトカインの非存在下で刺激したＴ細胞に対して）および標準誤差を示す。
図２ａ〜２ｃは、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１が、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞においてＲＯＲＣ２を誘導することを実証する。図２ｂは、３回の独立した実験についてのＩＬ−２１およびＩＬ−２２の平均倍数誘導および平均誤差を示す。
図２ａ〜２ｃは、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１が、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞においてＲＯＲＣ２を誘導することを実証する。図２ｃは、ナイーブ（ＣＤ４＋ ＣＤ２５− ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡｈｉ）Ｔヘルパー細胞について富化された集団へとソートした臍帯血から得られたＣＤ４＋ Ｔ細胞を示す。ソートしたＴ細胞を、示されたサイトカインの存在下で７日間にわたって刺激し、その時点で、ＲＮＡを回収し、ＩＬ−１７ＡおよびＲＯＲＣ２のレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。平均発現および標準誤差を、３名の異なるドナーに由来する臍帯血を使用する３回の独立した実験に基づいて報告する。
図２ｄは、分化の７日後の臍帯血ナイーブＴ細胞に由来するＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの細胞質内染色を示す。類似の結果は、別の独立したアッセイにおいて認められた。
図３は、ＬＴＢ４がＴＨ１７細胞の選択的走化性を誘導することを実証するデータを示す。Ｔｈ１７細胞もしくはＴｈ１細胞は、単独で、もしくはＬＴＢ４インヒビターであるＵ７５−３０２の種々の濃度と一緒に、下側のウェルにおいて１０−８ＭのＬＴＢ４を有する走化性チャンバの上側のウェルに添加した。細胞を、３７℃において、１０％ ＣＯ２中２時間にわたって維持した。次いで、下側のチャンバからの細胞を、抗ＣＤ４抗体で染色し、Ｇｏｌｇｉ Ｓｔｏｐの存在下で、ＰＭＡ／イオノマイシンで４時間にわたって刺激した。細胞を透過性にし、ＩＬ−１７もしくはＩＦＮ−γに対して細胞内で染色した。走化性指数を、ＬＴＢ４含有ウェル中のＣＤ４＋ ＩＬ−１７＋移動細胞の数（Ｔｈ１７細胞についての）もしくはＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋移動細胞の数（Ｔｈ１細胞について）を、培地単独で自発的に移動した、ＣＤ４＋ ＩＬ−１７＋細胞の数（Ｔｈ１７細胞について）もしくはＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ＋細胞の数（Ｔｈ１細胞について）で除算することによって計算した。
図４は、ＥＡＥを発症させるために、ミエリン抗原ＭＯＧ３５−５５で免疫した野生型マウスおよびＢＬＴ１ノックアウト（ＢＬＴ１ ＫＯ）マウスにおける自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床的経過を示す。ＢＬＴ１ＫＯマウスおよびＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを、ＭＯＧ３５−５５および百日咳毒素で免疫した。マウスを、ＥＡＥスケールに従って、０〜５にスコア付けした。グラフは、経時的なＥＡＥの臨床的経過を表す。
図５は、抗ポドプラニン抗体もしくはコントロールＰＢＳで処置したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥＡＥ経過を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＯＧ３５−５５＋百日咳毒素で免疫し、ＰＢＳもしくは１００μｇの抗ポドプラニン抗体を、免疫後の０日目、２日目、４日目、６日目、８日目に注射した。グラフは、各群についての経時的な平均ＥＡＥ臨床スコアを表す（各群においてｎ＝６マウス）。
図６は、サイトカインなし、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、およびＴＧＦ−β＋ＩＬ−６（Ｔｈ１７細胞）の存在下で活性化したナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞の遺伝子発現プロフィールのヒートマップである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞を、示された種々のサイトカインの存在下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激した。これら種々の集団に由来するｍＲＮＡを、３日後に調製し、遺伝子発現プロフィール作成を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）チップ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で行った。
図７は、種々のサイトカインの存在下で刺激したナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＢＬＴ１の相対的発現を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞を、種々のサイトカインの存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激した。ＩＬ−１７およびＢＬＴ１のｍＲＮＡの相対的発現を、インビトロ培養の３日後に、特異的プライマーおよびプローブを使用してリアルタイムＰＣＲによって決定した。
図８は、ヒトＴＨ１７細胞を誘導するために、サイトカインなし、もしくはＩＬ−２１＋ＴＧＦ−βのいずれかの存在下で刺激したＣＤ４＋ ヒトＴ細胞上でのＢＬＴ１の発現を示す。
図９は、ＴｈサブセットにおけるＢＬＴ１およびＩＬ−１７の発現を示す棒グラフである。ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞を、Ｔｈ１細胞についてはＩＬ−１２および抗ＩＬ−４の存在下で、Ｔｈ２細胞についてはＩＬ−４および抗ＩＦＮ−γの存在下で、ならびにＴｈ１７についてはＩＬ−６およびＴＧＦ−βの存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激した。
図１０は、種々のサイトカインの存在下で刺激したＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＩＬ−１７およびポドプラニンの相対的発現に関するデータを示す。
図１１は、種々のＴｈ細胞サブセットに関するポドプラニンの表面発現を示す。
図１２は、ＥＡＥの経過の間のＣＮＳからのマクロファージおよびミクログリア上での、ＩＬ−１７およびポドプラニンの発現を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＯＧ３５−５５および百日咳毒素で免疫した。マウスが、上記疾患のピークにおいて麻痺した場合、そのＣＮＳを回収し、単一の細胞懸濁物を調製した。マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋，ＣＤ４５ＲＢｈｉ）およびミクログリア細胞（ＣＤ１１ｂ＋，ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ）を、フローサイトメトリーによってソートした。これら２つの集団からｍＲＮＡを調製し、ＩＬ−１７およびポドプラニンの発現を、特異的プライマーおよびプローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって決定した。] 図１０ 図１１ 図１２ 図１ａ 図１ｂ 図１ｃ 図２ａ 図２ｂ 図２ｃ 図２ｄ
[0020] （詳細な説明）
本発明が本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、よって、変動し得ることは、理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図されない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。]
[0021] 本明細書でおよび特許請求の範囲において使用される場合、単数形は、複数形を含み、状況が明らかに逆のことを示さなければ、逆もまた同様である。作業実施例における以外は、もしくは他のことが示されている場合は、本明細書で使用される成分もしくは反応条件を表す全ての数値は、用語「約」が全ての場合において修飾すると理解されるべきである。]
[0022] 同定される全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るこのような刊行物に記載される方法論を記載および開示する目的で、本明細書に明示的に参考として援用される。これら刊行物は、本願の出願日前にそれらの開示についてのみ提供される。この点に関しては、本発明者らは、先行発明によってもしくはいかなる他の理由によってもこのような開示が先にくる権利があるということを認めるものとして解釈されるべきことは何らない。これら文書の内容に関する日付もしくは提示に関する全ての主張は、出願人に入手可能な情報に基づき、これら文書の日付もしくは内容の正確さに関して何らかの容認を構成しない。]
[0023] 別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。任意の公知の方法、デバイスおよび材料が、本発明の実施もしくは試験において使用され得るが、この点に関しては、上記方法、デバイスおよび材料は、本明細書で記載されている。]
[0024] 適応免疫系のＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）は、特定の病原体に対して宿主を保護するように進化してきた。Ｔｈ細胞は、これらが生成するサイトカインおよびこれらが達成するエフェクター機能の両方に依存して、３つのサブセットに分けられてきた。これらＴｈ細胞サブセットは、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、およびＴＨ１７細胞と称されている。近年、ＴＨ１７細胞は、炎症および自己免疫疾患の強力な誘導因子として明らかになってきた。それらの病原性機能を達成するためにＴＨ１７細胞によって使用される機構は、未だにわかりにくく、よって、ヒトＴＨ１７細胞の分化、特徴付け、および機能へのさらなる理解の必要性を駆り立てている。]
[0025] 本発明は、ヒトＴＨ１７細胞分化に必要とされる条件、ならびにヒトＴＨ１７細胞分化および機能性を調節するにおいて有用な組成物および方法を定義する。]
[0026] ＩＬ−１７（ＴＨ１７細胞）の分泌によって特徴付けられるＣＤ４＋ Ｔ細胞および調節性ＦｏｘＰ３＋ ＣＤ４ Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）の近年の発見は、伝統的なＴｈ１／Ｔｈ２パラダイムによって容易には説明されない免疫プロセスの理解に大きな衝撃を与えた。Ｋｉｋｌｙら，１８ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７０−７５（２００６）；Ｗｉｌｓｏｎら，８ Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏ．９５０−５７（２００７）。近年の研究は、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６が、ナイーブマウスＴ細胞の、ＴＨ１７細胞への分化を担うことを実証し、Ｔｈ１７表現型の安定化において重要な役割を果たし得ることが提唱されている。Ｂｅｔｔｅｌｌｉら，４４１ Ｎａｔｕｒｅ ２３５−５８（２００６）；Ｍａｎｇａｎら，４４１ Ｎａｔｕｒｅ ２３１−３４（２００６）；Ｖｅｌｄｈｏｅｎら，２４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７９−８９（２００６）。ＴＧＦ−βとＩＬ−２１との組み合わせがＩＬ−６の非存在下でマウスＴＨ１７細胞の分化を誘導し得る第２の経路もまた、発見された。Ｋｏｒｎら，４４８ Ｎａｔｕｒｅ ４８４−８７（２００７）；Ｎｕｒｉｅｖａら，４４８ Ｎａｔｕｒｅ ４８０−８３（２００７）；Ｚｈｏｕら，８ Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６７−７４（２００７）。]
[0027] しかし、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６は、ヒトＴＨ１７細胞を分化し得ない。Ｗｉｌｓｏｎら，２００７；Ａｃｏｓｔａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，８ Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４２−４９（２００７）。ＴＧＦ−βは、実際は、ヒトＴＨ１７細胞の発生を抑制し得ることが示唆された。Ｅｖａｎｓら，１０４ Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．１７０３４−３９（２００７）。事実、サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ−２３は、ヒト末梢血から単離された短期間ＣＤ４＋ Ｔ細胞株においてＩＬ−１７分泌を駆動し得ることが近年示された（Ｌａｕｒｅｎｃｅ ＆ Ｓｈｅａ，８ Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０３−０５（２００７））が、ナイーブヒトＣＤ４の、ＴＨ１７細胞への分化に必要される因子は、本発明まで未知のままであった。本発明は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６が、ヒト中心的記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞からＩＬ−１７Ａ分泌を誘導するが、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１は、ヒトナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞の、ＴＨ１７細胞への分化（ＲＯＲＣ２の発現によって達成される）を特有に促進することを提供する。本発明は、いまや、ヒト炎症性疾患においてＴＨ１７細胞の集団が果たす役割の調査を促進する。]
[0028] ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−１７Ａ分泌の調節のよりよい理解は、ナイーブＣＤ４リンパ球の、ＴＨ１７細胞への分化に対して、記憶Ｔ細胞からの、ＩＬ−１７発現細胞の増殖に対する種々のサイトカイン組み合わせの効果の評価を可能にするストラテジーを要した。具体的には、高速フローサイトメトリーを使用して、健康な被験体の末梢血からＣＤ４＋ Ｔ細胞のこれら２つの別個の集団をソートした：ナイーブＴ細胞について高度に富化した、ＣＤ４＋ ＣＤ２５− ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡｈｉ細胞および中心的記憶Ｔ細胞（Ｔｃｍ）について富化された、ＣＤ４＋ ＣＤ２５− ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡ−細胞（図１ａ）。ナイーブ表現型について富化された細胞は、ＣＣＲ７発現について一様に陽性であった。次いで、これら２つのＴ細胞集団を、プレート結合抗ＣＤ３モノクローナル抗体および可溶性抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で、ＣＤ４＋ Ｔ細胞分化に関与するサイトカインの種々の組み合わせを含む無血清培地中で、７日間にわたって刺激した。以前に報告されたように、サイトカインであるインターロイキン−１βは、Ｔｃｍから最も多量のＩＬ−１７Ａ分泌を誘導した（図１ｂ）。ＩＬ−６単独の添加は、ＩＬ−１７Ａの誘導に対してほとんど影響を有さず、ＩＬ−１βとともに添加した場合、ＩＬ−１７Ａ生成に対して相加効果も相乗効果も有さなかった。ＩＬ−２３の添加はまた、ＴｃｍからのＩＬ−１７Ａ分泌を適度に増強することができた。しかし、ＩＬ−１β単独もしくはＩＬ−６と一緒のいずれも、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からＩＬ−１７Ａ分泌を誘導できなかった。] 図１ａ 図１ｂ
[0029] 顕著に対照的に、ＴＧＦ−βとＩＬ−２１との組み合わせは、特有に、ＴＨ１７分化を誘導することができた。ＩＬ−２１、ＩＬ−１β、もしくはＩＬ−６は、ナイーブＴ細胞から顕著な量のＩＦＮ−β分泌を誘導したのに対して、ＴＧＦ−βとＩＬ−２１との添加は、ＩＦＮ−β分泌を抑制し、ＴＨ１７細胞の分化を誘導した。細胞質内染色は、ＥＬＩＳＡ結果と一致して、ＴＧＦ−βとＩＬ−２１との組み合わせが、ＩＬ−１７Ａのみを分泌し、ＩＦＮ−βを分泌しないＣＤ４＋ Ｔ細胞を分化させることを実証した（図１ｃ）。ＦＡＣＳで単離したナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞で始める場合、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のうちの１０％〜１５％が、分化のちょうど７日後にＩＬ−１７Ａを分泌する。] 図１ｃ
[0030] マウスモデルにおいて、ＴＨ１７分化は、マウスＲＯＲγｔ（マウスＩＬ−１７分泌Ｔ細胞の分化にとって重要な転写因子）の発現と一致する。ＲＯＲＣ２は、マウスＲＯＲγｔのヒトホモログであるので、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＲＯＲＣ２およびＴＨ１７分化に関与する他の分子のｍＲＮＡレベルを評価した。ＴＧＦ−βとＩＬ−２１との組み合わせは、ナイーブヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞からＩＬ−１７Ａ分泌を誘導するそれらの能力と一致して、高レベルのＲＯＲＣ２（図２ａ）を誘導した。マウスＴ細胞におけるＴＨ１７分化を誘導する、ＴＧＦ−βとＩＬ−６との組み合わせまた、ナイーブヒトＣＤ４細胞におけるＲＯＲＣ２の発現を誘導することは、特に興味深かった。しかし、サイトカインのこの組み合わせがＩＬ−１７Ａ分泌を誘導しなかったので、これらデータは、ヒトにおけるＲＯＲＣ２の発現が、本来ＩＬ−１７生成を誘導するに十分ではなく、もう一つは、ＲＯＲＣ２との組み合わせにおいて未だ同定されていない転写因子がＩＬ−１７Ａ分泌Ｔｈ１７細胞を誘導するために必要であり得ることを示す。] 図２ａ
[0031] Ｔｈ１およびＴｈ２細胞分化に関与するさらなる転写因子をまた、試験した：Ｔ−ｂｅｔは、ＩＦＮ−γ分泌Ｔｈ１細胞の主要レギュレーターであり、ＧＡＴＡ−３は、ＩＬ−４分泌Ｔｈ２細胞を誘導する。Ｔ−ｂｅｔのｍＲＮＡ発現レベルは、ＩＦＮ−γ分泌の量と非常に一致し、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１が、ＲＯＲＣ２発現とともにＴＨ１７細胞分化を誘導するが、ＴＧＦ−βは、ＩＬ−２１によるＴ−ｂｅｔの誘導を抑制するという知見と一致した。同様に、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１でのＧＡＴＡ−３の誘導はなかった。サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−２１およびＩＬ−１βは、ＴＧＦ−βを除いて、刺激したナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞においてＩＬ−２３レセプターアップレギュレーションを誘導した。Ｔｒｅｇ転写因子ＦｏｘＰ３の発現をまた、試験した。マウスおよびヒトの両方の系で以前に報告されたように、ＦｏｘＰ３は、ＴＧＦ−βによって誘導された。ＦｏｘＰ３のこの誘導は、ＩＬ−６およびより大きい程度にＩＬ−２１の両方（ＲＯＲＣ２を誘導する転写因子）によって阻害された。従って、ＲＯＲＣ２転写因子およびＦｏｘＰ３転写因子の誘導は、マウスとヒトのナイーブＣＤ４細胞との間で非常に類似していたが、ＴＧＦ−βとの組み合わせでのＩＬ−６によるＩＬ−１７Ａの誘導は、種間で一致しない。]
[0032] マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２１が、自己分泌ループにおいてＩＬ−２１の分泌を誘導し得ることは、以前に示された。Ｋｏｒｎら，２００７；Ｎｕｒｉｅｖａら，２００７；Ｚｈｏｕら，２００７；Ｗｅｏら，２８２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３４６０５−１０（２００７）。従って、ヒトＩＬ−２１が、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−２１分泌を誘導したか否かを評価し、ＴＧＦ−βとＩＬ−２１およびＩＬ−１βとの組み合わせの効果を、これらサイトカインがナイーブかつ中心的記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞からＩＬ−１７を誘導する能力を仮定して、同様に評価した。マウスにおいて認められた結果と一致して、ＩＬ−２１は、ＩＬ−２１を顕著にアップレギュレートしたが、ＩＬ−１βは、さらに多くの量のＩＬ−２１ｍＲＮＡを誘導した（図２ｂ）。しかし、マウスで認められたこととは対照的に、ＩＬ−２１はまた、いかなる外因性ＩＬ−２３の非存在下でもナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＩＬ−２２ ｍＲＮＡレベルを誘導した。ＴＧＦ−βは、対照的に、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡおよびＩＬ−２２ ｍＲＮＡの発現がＩＬ−２１によって誘導されたことを示唆した（図２ｂ）。これらデータは、マウスとヒトのＣＤ４＋ Ｔ細胞の間の差異をさらに強調する：ＩＬ−２１は、ＩＬ−２１およびＩＬ−２２を誘導するが、ＴＧＦ−βでのＴＨ１７細胞へのＴ細胞分化は、これらサイトカインの発現を阻害する。] 図２ｂ
[0033] ナイーブヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＴＨ１７細胞の分化におけるＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１の特有の機能を、ＣＤ４＋ ＣＤ２５− ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡｈｉ細胞を、ヒト臍帯血からソートすることによって確認した。臍帯血中のより高い割合のＣＤ４細胞は、健康な成人被験体から得られた末梢血と比較して、このナイーブ表現型を示した。刺激したナイーブ臍帯血Ｔ細胞から、ＩＬ−１７Ａ分泌を検出するのは困難であったが、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１は、ＩＬ−１７ＡｍＲＮＡおよびＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを誘導した（図２ｃ）。さらに、ＩＬ−２１単独で、ＲＯＲＣ２を適度に誘導したが、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１のみが、ＩＬ−１７Ａ ｍＲＮＡを誘導することができた。これらのデータは、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１が、ヒトおよびマウスの両方のＴＨ１７細胞の分化に重要であることをさらに示す。] 図２ｃ
[0034] 本発明は、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ—１７Ａ分泌の調節の理解を正確にしかつ拡げ、ヒトＴＨ１７細胞分化に必要とされる条件を定義する。ＩＬ−６もしくはＩＬ−２３と一緒のＩＬ−１βは、ＩＬ−１７Ａ分泌を誘導し得るが、これらサイトカインは、ヒト記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−１７Ａ発現を誘導するが、ヒトナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からは誘導しない。ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１は、組み合わせると、ヒトナイーブＴ細胞からのＴＨ１７細胞の分化に必要とされる。]
[0035] 文献において以前に報告された異なる結果の説明は、磁性ビーズ単離を用いて十分に純粋なナイーブＴ細胞を得ることができなかったか、またはＩＬ−６およびＴＧＦ−βの両方の実質的な量を含むことが公知のヒト血清を含む培地の使用（Ｗｉｌｓｏｎら，２００７）、および上記のサイトカインに加えて、ＩＦＮ−βおよびＩＬ−４の両方に対する中和抗体の使用のいずれかに起因し得る。Ａｃｏｓｔａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，２００７。]
[0036] 本研究は、炎症性応答の初期段階の間に誘導されたＩＬ−１βおよびＩＬ−６が、記憶Ｔ細胞に対して作用して、ＩＬ−１７およびＩＬ−２１の分泌を促進し得、誘導されたＩＬ−２１が、ＴＧＦ−βとともに、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＴＨ１７細胞の分化を促進し得るように相乗的に作用し得ることを示唆する。ＴＧＦ−βの一般的な免疫抑制性の特性は、ＩＬ−２１もしくはＩＬ−６によって誘導されるＩＦＮ−γの抑制の原因であり得る。にも拘わらず、ＩＦＮ−γが単純にないことが、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＴＨ１７分化を促進するには十分でない。なぜなら、ＴＨ１７分化は、ＩＦＮ−γ分泌が十分に抑制された場合に、ＴＧＦ−βとＩＬ−６との組み合わせで達成されなかったからである。広い範囲のＴＧＦ−βの用量を試験した。これは、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり、実際には、高用量のＴＧＦ−βにおいて、全ての分化／増殖が抑制された。成人および臍帯血の両方から上記ＦＡＣＳでソートしたナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＦｏｘＰ３発現に関してほとんど〜全く、検出可能でなかった。さらに、ＩＬ−２１単独では、ヒトＴＨ１７分化を誘導せず、これは、ＴＧＦ−βの存在を要する。従って、これらデータは、ＩＬ−２１が、Ｔｒｅｇ活性を抑制することによって、ＴＨ１７分化を単純に促進しないということを示す。さらに、Ｔ細胞が、ＩＬ−２１とともに相乗的に効果を発揮して、ＴＨ１７分化を促進するのに十分な量のＴＧＦ−βを生成し得ることは考えられるが、本明細書で表されるナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞は、十分量を生成しない。なぜなら、ＩＬ−２１単独の添加は、ＴＧＦ−βの内因性レベルとともに相乗的に効果を発揮して、ＩＬ−１７分泌を促進できなかったからである。]
[0037] 最終的には、サイトカインの組み合わせに応じるナイーブ細胞集団および記憶細胞集団の両方を同時に比較する実験的アプローチは、他者によって実験されるように、特定のサイトカインに応答する細胞集団についてのより信頼できる主張、すなわち、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６は、記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−１７分泌を誘導し、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１は、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−１７分泌ＣＤ４＋ Ｔ細胞の分化を誘導するという主張を可能にする。本発明は、いまや、感染および自己免疫疾患と関連するヒト炎症性Ｔｈ１７レセプターの特徴付けを可能にする。]
[0038] 従って、本発明の実施形態は、ＴＨ１７細胞分化および活性を調節するための方法および組成物に関する。上記方法および組成物は、例えば、本明細書に記載されるＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫関連の病気（例えば、喘息、アレルギー、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病、乾癬、重症筋無力症、もしくはＴＨ１７分化と関連した他の自己免疫障害）を処置（例えば、治癒、緩和、遅延もしくはその開始を予防、またはその再発もしくは逆戻りを予防）または予防することにおいて有用である。]
[0039] 一実施形態において、上記方法は、ヒトＴ細胞もしくはヒトＴ細胞集団と、ＴＧＦ−βアゴニストおよびＩＬ−２１アゴニストとを、上記Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団の、ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団への分化を誘導するのに十分な量において接触させる工程を包含する。従って、ＴＨ１７細胞活性および／もしくはＴＨ１７細胞数を増大させるための方法が提供される。例えば、ＴＨ１７の細胞活性および／もしくは細胞数は、ＴＨ１７細胞への分化（例えば、ナイーブＴ細胞の分化）を増大させることによって増大され得る。上記方法は、増大した分化が所望される細胞（Ｔ細胞）もしくは細胞集団を（必要に応じて）同定する工程、および上記細胞もしくは細胞集団と、ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１アゴニストとを、ＴＨ１７細胞への分化を増大させ、それによって、ＴＨ１７の細胞活性および／もしくは細胞数を増大させるために十分な量において接触させる工程を包含する。]
[0040] 関連の実施形態において、上記接触させる工程は、エキソビボ、インビトロもしくはインビボで行われる。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞を用いて行われるか、または患者（例えば、ヒト患者）において行われる。例えば、免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞）が、培養培地中、インビトロで培養され得、上記接触させる工程は、１種以上のＴＧＦ−β／ＩＬ−２１モジュレーター（ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１アゴニストもしくはアンタゴニスト）を培養培地に添加することによって行われ得る。あるいは、上記方法は、インビボでの（治療的もしくは予防的）プロトコルの一部として、被験体において存在する細胞（例えば、免疫細胞もしくはＴ細胞）で行われる。]
[0041] 上記ＴＧＦ−βアゴニストは、ＴＧＦ−βポリペプチド、ヒトＴＧＦ−βポリペプチド、もしくはこれらの活性フラグメント（例えば、組換えヒトＴＧＦ−βポリペプチドもしくはそのコード核酸）であり得る。上記ＴＧＦ−βアゴニストは、別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドもしくはその一部（例えば、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域））に融合されたＴＧＦ−βポリペプチド（例えば、ヒトＴＧＦ−βポリペプチド）もしくはそのフラグメントを含む融合タンパク質；上記ＴＧＦ−βレセプターＴＧＦ−βＲ）に対するアゴニスト抗体；または低分子アゴニストであり得る。ヒト組換えＴＧＦ−βは、市販されている（例えば、Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡおよびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから）。組換えＴＧＦ−βＲ複合体の再構成およびトランスリン酸化（ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）がまた、報告された。Ｖｅｎｔｕｒａら，１３（２３）ＥＭＢＯ Ｊ．５５８１−８９（１９９４）。ＴＧＦ−β発現はまた、他のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）を使用してアップレギュレートされ得る。Ｓｕｌｌｉｖａｎら，ＡＪＲＣＭＢ（Ｊａｎ．１４，２００５）。]
[0042] 上記ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド、もしくはその活性フラグメント（例えば、組換えヒトＩＬ−２１ポリペプチドもしくはそのコード核酸）であり得る。上記ＩＬ−２１アゴニストは、別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドもしくはその一部（例えば、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域））に融合されたＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）もしくはそのフラグメントを含む融合タンパク質；上記ＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）に対するアゴニスト抗体；または低分子アゴニストであり得る。組換えヒトＩＬ−２１は、市販されている（例えば、Ｐｒｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）から）。さらに、ヒトＩＬ−２１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ＿０１１０８２において入手可能である。マウスＩＬ−２１ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードする核酸は、ＷＯ／２００４／００７６８２において例示されている。他の実施形態において、上記ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１の活性もしくはレベルを、例えば、機能的ＩＬ−２１の発現、プロセシングおよび／もしくは分泌を増大させることによって、増大させる薬剤である。]
[0043] 別の実施形態において、本発明は、ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団への前駆Ｔ細胞もしくは前駆Ｔ細胞集団の分化を阻害するための方法を提供する。上記方法は、上記Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団と、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストとを、またはＴＧＦ−βＲおよびＩＬ−２１Ｒとを、ＴＨ１７細胞分化を阻害するのに十分な量において接触させる工程を包含する。上記ＴＧＦ−βアンタゴニストは、例えば、抗ＴＧＦ−βＲ抗体、抗ＴＧＦ−βＲ抗体の抗原結合フラグメント、またはＴＧＦ−βＲの可溶性フラグメントであり得る。上記ＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば、抗ＩＬ２１Ｒ抗体、抗ＩＬ２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、またはＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり得る。ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１、もしくはそれらのレセプター遺伝子の発現は、例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、前述の人工誘導体などでのＲＮＡ干渉によって抑制し得る。]
[0044] ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１媒介性のＴヘルパー細胞効果を阻害するＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１のアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＲへの相互作用もしくはＩＬ−２１のＩＬ−２１Ｒへの相互作用をブロックするもしくは別の方法で阻害する薬剤が、Ｔ細胞もしくはＴ細胞の集団に添加され得る。これらアンタゴニストとしては、例えば、ＴＧＦ−βもしくはＩＬ−２１ポリペプチドの可溶性フラグメント、ＴＧＦ−βＲフラグメントもしくはＩＬ−２１Ｒフラグメント、これらフラグメントを含む融合タンパク質、およびこれらフラグメントに対する抗体が挙げられる。]
[0045] 抗体は、ヒト抗体種の全てのこのようなクラス、サブクラスおよびタイプを含む。例えば、ＴＧＦ−βポリペプチドもしくはＴＧＦ−βＲポリペプチドに対する抗体はまた、ＴＧＦ−βポリペプチドもしくはＴＧＦ−βＲポリペプチド、またはＴＧＦ−βポリペプチドもしくはＴＧＦ−βＲポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質に対する抗体を含む。同様に、ＩＬ−２１ポリペプチドもしくはＩＬ−２１Ｒポリペプチドに対する抗体はまた、ＩＬ−２１ポリペプチドもしくはＩＬ−２１Ｒポリペプチド、またはＩＬ−２１ポリペプチドもしくはＩＬ−２１Ｒポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質に対する抗体を含む。]
[0046] より具体的には、上記ＴＧＦ−βアンタゴニストは、ＴＧＦ−βもしくはヒトＴＧＦ−β、またはＴＧＦ−βＲポリペプチドに対する、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくは単一特異性抗体）であり得る。上記抗体は、ヒトＴＧＦ−βポリペプチドもしくはヒトＴＧＦ−βＲポリペプチドに対する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、もしくはインビトロで生成された抗体であり得る。他の実施形態において、上記アンタゴニストは、ＴＧＦ−βポリペプチドのフラグメント（例えば、ＴＧＦ−βポリペプチドのＴＧＦ−β結合ドメイン）を含む。あるいは、上記アンタゴニストは、ＴＧＦ−βＲポリペプチドのフラグメント（例えば、ＴＧＦ−βＲポリペプチドのＴＧＦ−β結合ドメイン）を含む。一実施形態において、上記アンタゴニストは、第２の部分（例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖））に融合された前述のＴＧＦ−βポリペプチドもしくはＴＧＦ−βＲポリペプチド、またはこれらのフラグメントを含む融合タンパク質である。抗ＴＧＦ−β抗体は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路に関与するタンパク質を標的とする多くの抗体と同様に、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））。内因性ＴＧＦ−βを阻害する薬剤は、ピルフェニドン（ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）（Ｌｉｕら，５ Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１２６６−６３（２００５）、もしくは米国特許第７，３１４，９３９号に記載されるもののような他の化合物を含む。ＴＧＢ−βシグナル伝達を阻害する薬剤は、ハロフジノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）（Ｆｉｇｕｅｉｒｏ−Ｐｏｎｔｓら，９２（２）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １７７（２００７））、ゲニステイン、およびクルクミン（Ｓａｎｔｉｂａｎｅｚら，３７（１）Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｃａｎｃｅｒ，４９−５４（２０００））を含む。]
[0047] さらなるＴＧＦ−βスーパーファミリーモジュレーターとしては、ＡｍｎｉｏｎｌｅｓｓＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ ＮＯＭＯ、Ｃａｒｏｎｔｅ ＰＲＤＣ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ １ＳＫＩ、Ｃｈｏｒｄｉｎ Ｓｍａｄ１、Ｃｈｏｒｄｉｎ−Ｌｉｋｅ １ Ｓｍａｄ２、Ｃｈｏｒｄｉｎ−Ｌｉｋｅ ２ Ｓｍａｄ３、ＣＯＣＯ Ｓｍａｄ４、ＣＲＩＭ１ Ｓｍａｄ５、Ｃｒｉｐｔｏ Ｓｍａｄ７、Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ−２ Ｓｍａｄ８、ＣｒｙｐｔｉｃＳＯＳＴ／Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＤＡＮ Ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−β ｂｐ１、Ｄｅｃｏｒｉｎ Ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−β ｂｐ２、Ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ Ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−β ｂｐ４、ＦＬＲＧ ＴＭＥＦＦ１／Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ−１、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ＴＭＥＦＦ２、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １ ＴＳＧ、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ ＴＳＫ、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ Ｖａｓｏｒｉｎ、Ｇｒｅｍｌｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から）が挙げられる。]
[0048] 上記ＩＬ−２１アンタゴニストは、ＩＬ−２１もしくはヒトＩＬ−２１、またはＩＬ−２１Ｒポリペプチドに対する、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくは単一特異性抗体）であり得る。上記抗体は、ヒトＩＬ−２１ポリペプチドもしくはヒトＩＬ−２１Ｒポリペプチドに対する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、もしくはインビトロで生成される抗体であり得る。他の実施形態において、上記アンタゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドのＩＬ−２１Ｒ結合ドメイン）を含む。あるいは、上記アンタゴニストは、ＩＬ−２１Ｒポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１ＲポリペプチドのＩＬ−２１結合ドメイン）を含む。一実施形態において、上記アンタゴニストは、第２の部分（例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖））に融合された前述のＩＬ−２１ポリペプチドもしくはＩｌ−２１Ｒポリペプチドまたはそれらのフラグメントを含む融合タンパク質である。]
[0049] 例えば、市販のＩＬ−２１モジュレーターとしては、ヒトＩＬ−２１Ｒ、組換えヒトＩＬ−２１Ｒ／Ｆｃキメラ、ヒトＩＬ−２１ＲアロフィコシアニンＭＡｂ、ヒトＩＬ−２１Ｒビオチン化ＰＡｂ、ヒトＩＬ−２１Ｒ ＭＡｂ、およびヒトＩＬ−２１ＲフィコエリトリンＭＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製）が挙げられる。他の薬剤は、ＩＬ−２１遺伝子発現のアンタゴニストとして働き得る。例えば、シクロスポリンは、上記ＩＬ−２１プロモーターを阻害する。Ｋｉｍら，２８０（２６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）。他のＩＬ−２１アンタゴニストは、米国特許第７，１８６，８０５号および同第６，９２９，９３２号に報告されている。ＩＬ−２１Ｒに結合するＩＬ−２１変異体に関する。]
[0050] 別の実施形態において、本発明は、ヒト、Ｔ細胞もしくはヒトＴ細胞集団において、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γもしくはＩＬ−１７）の活性もしくはレベルを調節する（例えば、増大もしくは減少もしくは阻害するための方法）を特徴とする。例えば、Ｔ細胞もしくはＴＨ１７細胞、もしくはこれらの細胞集団における、ＩＬ−１７の活性、発現、分泌、もしくはプロセシングのうちの１つ以上を調節するための方法が、提供される。上記方法は、ＩＬ−１７の活性もしくはレベルの調節（増大もしくは減少）が所望される細胞を、（必要に応じて）同定する工程；および上記細胞もしくは細胞集団と、上記細胞もしくは細胞集団におけるＩＬ−１７の活性もしくはレベルを調節するために十分な量のＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のモジュレーター（例えば、ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のアゴニストもしくはアンタゴニスト）とを接触させる工程を包含する。上記のように、上記接触させる工程は、エキソビボ、インビトロ、もしくはインビボで行われ得る。例えば、上記接触させる工程は、ヒト細胞を使用して行われ得るか、またはヒト患者において行われ得る。]
[0051] 顕著なことには、本明細書で議論されるＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のモジュレーターは、ＩＬ−１７レベルもしくは活性を特異的に阻害し得るが、同様に、ＩＬ−１７発現もしくはＴｈ１７機能性と関連する他のサイトカインの活性もしくはレベルを減少もしくは阻害し得る。例えば、上記ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のアゴニストは、ＩＦＮ−γ生成細胞（例えば、Ｔｈ１細胞）によるＩＦＮ−γの生成を阻害する。]
[0052] 上記ＴＧＦ−βポリペプチドもしくはＴＧＦ−βＲポリペプチド部分は、（変異されていない配列と比較して）タンパク質分解に対してより耐性のあるＴＧＦ−βもしくはＴＧＦ−βＲ配列を生じる、天然に存在するＴＧＦ−βもしくはＴＧＦ−βＲ配列（野生型）における変異を有する改変ＴＧＦ−βもしくはＴＧＦ−βＲポリペプチドであり得る。同様に、上記ＩＬ−２１ポリペプチドもしくはＩＬ−２１Ｒポリペプチド部分は、（変異していない配列と比較して）タンパク質分解に対してより耐性のあるＩＬ−２１もしくはＩＬ−２１Ｒ配列を生じる、天然に存在するＩＬ−２１もしくはＩＬ−２１Ｒ配列（野生型）における変異を有する改変ＩＬ−２１もしくは改変ＩＬ−２１Ｒポリペプチドであり得る。]
[0053] ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βＲ、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒ、もしくはこれらタンパク質の活性フラグメントは、本明細書で記載される方法において使用するための免疫グロブリンのようなキャリア分子に融合され得る。例えば、上記レセプターの可溶性形態は、上記免疫グロブリンのＦｃ部分もしくは上記免疫グロブリンの上記Ｆｃ部分に「リンカー」配列を介して融合され得る。他の融合タンパク質（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＬｅｘＡ、もしくはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を有するもの）がまた、使用され得る。]
[0054] さらなる実施形態において、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βＲ、ＩＬ−２１もしくはＩＬ−２１Ｒの融合タンパク質は、１つ以上のさらなる部分に連結され得る。例えば、上記融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質にさらに連結され得る。ここで上記融合タンパク質配列は、上記ＧＳＴ配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、上記ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βＲ、ＩＬ−２１もしくはＩＬ−２１Ｒの融合タンパク質の精製を容易にし得る。]
[0055] 別の実施形態において、上記融合タンパク質は、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βＲ、ＩＬ−２１もしくはＩＬ−２１Ｒの核酸）によって天然にコードされるポリペプチドに存在しない異種シグナル配列（すなわち、ポリペプチド配列を、そのＮ末端において含む。例えば、上記ネイティブのシグナル配列は除去され得、別のタンパク質に由来するシグナル配列で置換され得る。]
[0056] 本発明のキメラタンパク質もしくは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端化したもしくは付着末端化した末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合、粘着末端を充填すること、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することによって、インフレームで一緒に連結される。別の実施形態において、上記融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成され得る。]
[0057] 上記のように、本明細書に記載される方法は、インビトロもしくはエキソビボで、細胞（例えば、Ｔ細胞）で使用され得る。あるいは、上記方法は、インビボ（例えば、治療的もしくは予防的）プロトコルの一部として、被験体に存在する細胞に対して行われ得る。例えば、上記方法は、被験体におけるＴｈ１７媒介性障害を処置もしくは予防するために使用され得る。よって、本発明は、被験体におけるＴｈ１７関連障害を処置（例えば、治癒、抑制、緩和、遅延もしくはその開始を予防するか、またはその再発もしくは逆戻りを予防）するか、または予防するための方法を提供する。上記方法は、被験体に、ＴＨ１７細胞活性および／もしくは細胞数を減少させるに十分な量において、ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のアンタゴニストを投与し、それによって、Ｔｈ１７関連障害を処置もしくは予防する工程を包含する。]
[0058] 上記被験体は、異常なＴＨ１７細胞の数もしくは活性と関連する障害（例えば、免疫障害）に罹患している哺乳動物（例えば、ヒト）である。上記ＴＨ１７細胞活性および／もしくはＴＨ１７細胞数を阻害もしくは低下させるために十分な量は、上記障害を緩和もしくは予防するために十分な量である。]
[0059] 本発明において有効な上記ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のモジュレーター、より具体的には、アゴニストもしくはアンタゴニストとして働く化学的薬剤もしくは化合物としては、プロドラッグが挙げられる。用語「プロドラッグ」とは、このようなプロドラッグが哺乳動物被験体に投与された場合に、活性な親薬物をインビボで放出する任意の化合物をいう。化合物のプロドラッグは、代表的には、改変が上記親化合物を放出するように、インビボで切断され得る様式において、上記化合物に存在する１つ以上の官能基を改変することによって、調製される。プロドラッグの例としては、エステル（例えば、アセテート、ホルメート、およびベンゾエート誘導体）およびヒドロキシル官能基のカルバメート（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）、ならびにアミノ官能基のアミド、カルバメートおよびウレア誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。プロドラッグ形態は、しばしば、哺乳動物器官において、溶解度、組織適合性、もしくは遅延した放出に役立つ。Ｂｕｎｄｇａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ Ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，７−９，２１−２４（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｄｒｕｇ Ａｃｔｉｏｎ，３５２−４０１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を参照のこと。さらに、本発明のプロドラッグ誘導体は、バイオアベイラビリティーを増強するために、当業者に公知の他の特徴と組み合わせられ得る。]
[0060] 本明細書に記載されるＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のモジュレーターは、便利には、薬学的組成物中に提供され得る。上記組成物は、内在的な使用に適している可能性があり、有効量の本発明の薬理学的に活性な化合物を、単独もしくは組み合わせにおいて、１種以上の薬学的に受容可能なキャリアとともに含む。上記化合物は、それらが、あるにしても、非常に低い毒性を有するという点で特に有用である。実際問題として、上記化合物もしくはそれらの薬学的に需要可能な塩は、所望の変化（例えば、ＴＨ１７細胞分化の増大もしくは減少）をもたらすに十分な量において投与され、このような目的に最も適した薬学的形態において使用される。]
[0061] 薬学的使用に関しては、本発明のタンパク質は、従来の方法に従って、非経口的送達（特に、静脈内送達もしくは皮下送達）のために処方される。生体活性ポリペプチドもしくは本明細書に記載される抗体結合体は、静脈内に、動脈内に、もしくは導管内に送達され得るか、または意図した作用部位に局所的に導入され得る。静脈内投与は、１時間〜数時間の代表的期間にわたるボーラス注射もしくは注入物である。一般に、薬学的処方物は、薬学的に受容可能なビヒクル（例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、水中の５％デキストロースなど）と組み合わせて、ＩＬ−２１タンパク質を含む。処方物は、バイアル表面でのタンパク質損失を防止するなどのために、１種以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝化剤、アルブミンをさらに含み得る。処方の方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｓｃｉ． ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１９版，１９９５）に開示されている。治療的用量は、一般に、１日あたり患者の体重で、０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの範囲内（例えば、１日あたり０．５μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ）であり得る。正確な用量は、処置されるべき状態の性質および重篤度、患者の形質などを考慮に入れて、許容された標準に従って臨床医によって決定される。用量の決定は、当業者の技術レベルの範囲内である。上記タンパク質は、急性処置のために、１週間以下にわたって、しばしば、１〜３日間の期間にわたって投与されてもよいし、慢性処置において、数ヶ月もしくは数年にわたって使用されてもよい。一般に、治療上有効な量の上記ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１のモジュレーターは、造血機能もしくは免疫機能において臨床的に顕著な変化を生じるに十分な量である。]
[0062] 例えば、錠剤もしくはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル剤）に形態における経口投与に関しては、上記活性な薬物成分は、経口用の、非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と合わせられ得る。さらに、所望のもしくは必要な場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤がまた、上記混合物中に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／もしくはポリビニルピロリドン、天然の糖（例えば、グルコースもしくはβ−ラクトース）、トウモロコシ甘味剤、天然および合成のガム（例えば、アカシアガム、トラガカントガム）もしくはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これら投薬形態において使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または起沸性の混合物（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／もしくはグリシンが挙げられる。]
[0063] 注射用組成物は、好ましくは、等張性水溶液もしくは懸濁物であり、坐剤は、有利なことには、脂肪性エマルジョンもしくは懸濁物から調製される。上記組成物は、滅菌され得るか、そして／または補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、可溶化促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝化剤）を含み得る。さらに、それらはまた、他の治療上価値のある物質を含み得る。上記組成物は、それぞれ、従来の混合、過硫化もしくはコーティング方法に従って、調製され、約０．１％〜７５％（例えば、約１％〜５０％）の上記活性成分を含む。より具体的には、本明細書で議論される薬学的組成物のうちのいずれかが、０．１％〜９９％（例えば、１％〜７０％の上記ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１、ＴＧＦ−βＲ／ＩＬ−２１Ｒ、ＴＧＦ−β／ＩＬ−２１アゴニスト、またはＴＧＦ−β／ＩＬ−２１アンタゴニスト）を含み得る。]
[0064] 本発明の化合物はまた、時間放出のおよび徐放性の錠剤もしくはカプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ、懸濁物、シロップ剤およびエマルジョンのような経口投与形態において投与され得る。]
[0065] 液体、特に注射用組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。上記活性成分は、薬学的に純粋な溶媒（例えば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなど）に溶解もしくは混合されて、それによって、注射用溶液もしくは懸濁物を形成する。さらに、注射前に液体に溶解するのに適した固体形態が、処方され得る。注射用組成物は、好ましくは、等張性水溶液もしくは懸濁物である。上記組成物は、滅菌され得、そして／または補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、可溶化促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝化剤）を含み得る。さらに、それらはまた、他の治療上価値のある物質を含み得る。]
[0066] 本発明の化合物は、静脈内（ボーラスもしくは注入の両方）、腹腔内、皮下、もしくは筋肉内形態において、全て、薬学分野の当業者に周知の形態を使用して、投与され得る。注射物は、従来の形態において、液体溶液もしくは懸濁物のいずれかとして、調製され得る。]
[0067] 非経口的な注射物投与は、一般に、皮下、筋肉内、もしくは静脈内の注射もしくは注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、遅延放出もしくは徐放性の系の移植を使用し、これは、米国特許第３，７１０，７９５号によれば、一定レベルの投薬量が維持されることが確実である。]
[0068] さらに、本発明の化合物は、適切な鼻内ビヒクルの局所的使用を介して、もしくは経皮経路を介して、当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態を使用して、鼻内形態において投与され得る。経皮送達システムの形態において投与されるために、上記投与量の投与は、当然のことながら、投与レジメン全体を通して断続性ではなく、連続性である。他の好ましい局所調製物としては、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアロゾルスプレーおよびゲルが挙げられ、ここで活性成分の濃度は、０．１％〜１５％（ｗ／ｗもしくはｗ／ｖ）の範囲に及ぶ。]
[0069] 固体組成物に関しては、賦形剤は、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられ、これらが使用され得る。上記で定義される活性化合物はまた、キャリアとして例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）を使用して、坐剤として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐剤は、有利なことには、脂肪性エマルジョンもしくは懸濁物から調製される。]
[0070] 本発明の化合物はまた、リポソーム送達系（例えば、小さな単層小胞、大きな単層小胞、および多層小胞）の形態において投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質（コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンを含む）から形成され得る。いくつかの実施形態において、脂質成分のフィルムは、薬物の水溶液で水和されて、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、上記薬物を被包する脂質層を、形成する。]
[0071] 本発明の化合物はまた、上記化合物分子が連結される個々のキャリアとしてのモノクローナル抗体の使用によって送達され得る。本発明の化合物はまた、標的可能な薬物キャリアとして可溶性ポリマーと連結され得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌａｓｐａｎａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、もしくはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するにおいて有用な生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋されたもしくは両親媒性ブロックコポリマー）のクラスに連結され得る。]
[0072] あるいは、完全遺伝子送達ベクターが、組換えＴ細胞からインタクトなまま生成され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、上記遺伝子送達系を生成する１つ以上の細胞を含み得る。]
[0073] 所望される場合、投与されるべき薬学的組成物はまた、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなど））を含み得る。]
[0074] 上記化合物を利用する投与レジメンは、種々の要因（患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的な状態；処置されるべき状態の重篤度；投与経路；上記患者の腎機能および肝機能；ならびに使用される特定の化合物もしくはその塩が挙げられる）に従って選択される。通常の技術をもった医師もしくは獣医師は、上記状態の進行を予防するか、これに対抗するか、もしくはこれを停止するために必要とされる薬物の有効量を容易に決定しかつ処方し得る。]
[0075] 本発明の経口投薬量は、示される効果について使用される場合、経口で、約０．０５ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日の間の範囲に及ぶ。本発明の化合物の有効血漿レベルは、１日あたり、０．００２ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ 体重の範囲に及ぶ。本発明の化合物は、単一の１日用量で投与されてもよいし、合計の１日用量が、１日に２回、３回もしくは４回の分割用量において投与されてもよい。]
[0076] 本発明のさらなる実施形態は、ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団の活性を調節するための方法を提供し、上記方法は、上記細胞もしくは細胞集団と、ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団の活性を調節するのに十分な量のＴｈ１７活性モジュレーターとを接触させる工程を包含する。例えば、ＴＨ１７細胞の移動活性は、Ｕ７５−３０２（Ｔｈ１７特異的ロイコトリエンＢ４のアンタゴニスト）によって阻害され得る。同様に、上記ＴＨ１７細胞の移動活性は、ポドプラニンによって阻害され得る。このようなＴｈ１７活性特異的モジュレーターは、インビトロおよびインビボでの使用についての前述の議論に従って、処方され得る。]
[0077] 本発明はまた、ＴＨ１７細胞において特異的にアップレギュレートされる細胞表面分子を介したＴＨ１７細胞の同定を提供する。より具体的には、ＴＨ１７細へと分化したナイーブＴ細胞と、ＩＬ−６単独もしくはＴＧＦ−β単独のいずれかの存在下で培養したＴ細胞とを比較する発現プロフィール作成は、ＴＨ１７細胞（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６の存在下で分化した）において特異的に発現されるが、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、もしくはサイトカインなしの存在下で活性化されたナイーブＴ細胞では発現されない遺伝子を同定した。発表された文献と一致して、ＩＬ−１７Ａ、ならびに転写因子であるＲＯＲγｔおよびＲＯＲαは、他の条件で培養された細胞と比較すると、ＴＨ１７細胞においてアップレギュレートされた。Ｉｖａｎｏｖら，１２６ Ｃｅｌｌ １１２１−３３（２００６）；Ｙａｎｇら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００７）。２つの表面分子：ＢＬＴ１（ＬＴＢ４Ｒ１）（ロイコトリエンＢ４のレセプター）、およびポドプラニンは、ＴＨ１７細胞において特異的にアップレギュレートされる（図６）。] 図６
[0078] 本発明のマーカーを使用すると、ＴＨ１７細胞は、サンプル中で同定され得る。上記「サンプル」もしくは「生物学的サンプル」は、被験体のヒト（もしくは動物）から直接採取された任意の生物学的材料、もしくは培養（富化）後の任意の生物学的材料であり得る。生物学的材料は、任意の種の気管支洗浄（ｂｒｏｎｃｈｅｏｌａｖａｇｅ）の喀出物、血液、皮膚組織、生検物、精液、リンパ球、血液培養物質、コロニー、液体培養物、糞便サンプル、尿などが挙げられ得る。生物学的材料はまた、細胞培養物もしくはその液相を含み得る。用語「生物学的サンプル」とは、一般に、ＴＨ１７細胞を含む任意の生物学的サンプル（組織もしくは流体）に言及し、血清もしくは血漿サンプルを含む。]
[0079] 上記サンプルは、被験体から回収され得、これは、健康状態および／もしくは疾患状態に、個体に言及する。被験体は、患者、研究参加者、コントロール被験体、スクリーニング被験体、もしくはサンプルが得られかつ本発明の状況において評価される任意の他のクラスの個体であり得る。被験体は、疾患を有すると診断され得、疾患の１つ以上の症状、もしくは疾患についての素因因子（例えば、家族（遺伝）歴もしくは病歴（医療的）因子とともに示され得る。あるいは、被験体は、前述の要因もしくは基準のうちのいずれかに関して健康であり得るが、用語「健康な」とは、特定の疾患、もしくは疾患要因、もしくは疾患基準に関するものであり、任意の絶対評価もしくは状態に対応するように定義することはできない。従って、任意の特定の疾患もしくは疾患状態に関して健康であると定義された個体は、実際には、任意の他の１つ以上の疾患を有すると診断され得るか、または他の１つ以上の疾患基準を示し得る。]
[0080] さらに、本発明の考察は、焦点を当て、ヒトおよびマウス細胞およびマーカーを使用して例示されるが、特定のマーカーは、他の非ヒト動物に適切であり得、そして研究および獣医学実践における用途を有し得る。]
[0081] 本発明のＴＨ１７細胞特異的マーカーは、抗体によって同定され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のうちのいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば、生物学的サンプル中のＴｈ１７マーカーの検出において、あるいは本明細書で記載されるＴｈ１７機能のモジュレーターとして使用され得る。従って、このような抗体は、自己免疫もしくは他の疾患処置方法の一部として利用され得るか、そして／または診断技術の一部として使用され得、それによって、患者が、Ｔｈ１７特異的マーカーの異常なレベルについて試験され得る。]
[0082] 免疫アッセイを行うための多くのプロトコルは、公知であり、これは、例えば、競合、もしくは直接反応、もしくはサンドイッチアッセイに基づいて使用され得る。プロトコルは、固体支持体もしくは免疫沈降を使用し得る。イムノアッセイは、一般に、標識された抗体もしくはポリペプチドの使用を包含する。上記標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子、もしくは色素分子であり得る。本発明の特定の局面は、基材に結合したポドプラニンおよび／もしくはＢＬＴ１を認識し得る分子を提供する。]
[0083] 本発明のマーカーはまた、核酸分子を介するそれらの発現を評価することによって、同定され得る。発現データを得るための多くの方法が公知であり、これら技術のうちのいずれか１つ以上は、単一でも組み合わせにおいても、本発明の状況において発現プロフィールを決定するために適している。例えば、発現パターンは、ノーザン分析、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｔａｑ Ｍａｎ分析、ＦＲＥＴ検出、１種以上の分子ビーコンのモニタリング、オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション、液相マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、微小電子アレイへのハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ配列決定、クローンハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡフラグメントフィンガープリント、遺伝子発現の逐次分析（ＳＡＧＥ）、差し引きハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイおよび／またはディファレンシャルスクリーニングによって評価され得る。例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔ ＆ Ｗｉｎｚｅｌｅｒ ４０５ Ｎａｔｕｒｅ ８２７−３６（２０００）；米国特許第６，９０５，８２７号を参照のこと。]
[0084] 本発明はまた、ＴＨ１７細胞の同定のためのキットを提供する。代表的には、キットは、１つ以上のプローブ（例えば、抗体もしくは診断用ヌクレオチド）を含む。上記プローブは、適切な容器中にパッケージされた診断用ヌクレオチドプローブセットの一部、もしくは他の候補ライブラリーのセット（例えば、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、もしくは抗体マイクロアレイ、または任意の発現プロフィール作成技術を使用して診断用遺伝子セットに関するアッセイを行うための試薬として）として存在し得る。上記キットは、１種以上のさらなる試薬（例えば、基材、標識、発現生成物を標識するためのプライマー、チューブおよび／もしくは他のアクセサリ、血液サンプルを採取するための試薬、緩衝化剤（例えば、赤血球溶解緩衝化剤、白血球溶解緩衝化剤）、ハイブリダイゼーションチャンバ、カバースリップなど、ならびにソフトウェアパッケージ（例えば、本発明の統計法（例えば、上記のもの）を含む）ならびに編集されたデータベースにアクセスするためのパスワードおよび／もしくはアカウント番号をさらに含み得る。上記キットは、必要に応じて、本発明の方法において診断用プローブを使用する好ましい方法を詳述する導入セットもしくはユーザーマニュアルをさらに含む。]
[0085] ＴＨ１７細胞を同定するための方法およびキットは、被験体（例えば、および患者もしくは個体）がＴＨ１７細胞を有する場合、同定もしくは決定（定性的もしくは定量的に）ために使用され得る。いくつかの場合において、ＴＨ１７細胞は、自己免疫障害と関連し得る。自己免疫障害は、患者の免疫系が、その患者の器官もしくは組織中の抗原を異物として認識し、活性化されてしまう疾患状態として定義される。次いで、上記活性化された免疫細胞は、上記刺激している器官もしくは組織に損傷を引き起こし得るか、または他の器官もしくは組織に損傷を引き起こし得る。いくつかの場合において、上記障害は、自己抗原を異物として認識するというよりむしろ、上記免疫系細胞の誤調節によって引き起こされ得る。誤調節された免疫細胞は、全身性の炎症を引き起こす炎症性サイトカインを分泌し得るか、または異物として自己抗原を認識し得る。]
[0086] 自己免疫疾患の例としては、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊髄炎、シェーグレン病、クレスト症候群、および強皮症が挙げられる。上記自己免疫疾患の大部分はまた、慢性炎症性疾患である。これは、炎症性細胞（白血球）の長期の（＞６ヶ月）活性化と関連する疾患プロセスとして定義される。上記慢性炎症は、患者の器官もしくは組織の損傷をもたらす。多くの疾患は、慢性炎症性障害であるが、自己免疫ベースを有さないことも知られている。例としては、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性多発動脈炎、ホイップル病、および原発性硬化性胆管炎が挙げられる。]
[0087] ＴＨ１７細胞の同定は、自己免疫障害を有する患者をモニターすることにおいて有用であり得る。モニターすることは、個体または個体の健康状態もしくは疾患状態についての有用な情報を提供するための、ＴＨ１７細胞マーカーの観察を記載する。「モニターすること」は、予後の決定、リスク階層化、薬物治療の選択、進行中の薬物療法の評価、結果の予測、治療への応答を決定すること、疾患もしくは合併症の診断、疾患の以後の進行、または患者健康状態に関する任意の情報の提供が挙げられ得る。]
[0088] さらに関節リウマチ（ＲＡ）に関して、本発明のＴｈ１７特異的細胞表面分子は、ＲＡの診断もしくはモニタリングにおいて使用され得る。ＲＡは、米国において約２００万人に変化をもたらし、慢性および衰弱していく炎症性関節炎であり、特に、関節の疼痛および破壊を伴う。ＲＡはしばしば、患者が疼痛を有さない可能性があるので診断されないままであるが、上記疾患は、上記関節を活発に破壊する。他の患者は、ＲＡを有することが既知であり、症状を緩和するために処置されているが、関節破壊が進行する速度は、容易にはモニターされない。薬物治療は利用可能であるが、最も有効な医薬は、毒性（例えば、ステロイド、メトトレキサート）であり、注意して使用されるべきである。新たなクラスの薬物療法（ＴＮＦブロッカー）は有効であるが、上記薬物は高価であり、副作用を有し、全ての患者が応答するわけではない。]
[0089] ＲＡ疾患基準は、疾患症状（例えば、関節疼痛、関節腫脹および関節硬直）、ならびにＲＡの診断、関節破壊の進行（例えば、連続的手動放射線写真（ｓｅｒｉａｌ ｈａｎｄ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ）、関節機能および関節可動性の評価によって測定される場合）、手術、薬物療法の必要性、炎症状態および非炎症状態のさらなる診断、ならびに臨床的実験測定値（差異とともに全血球数（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｕｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓ）、ＣＲＰ、ＥＳＲ、ＡＮＡ、血清ＩＬ６、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＬＤＬ、ＨＤＬ、抗ＤＮＡ抗体、リウマチ因子、Ｃ３、Ｃ４、血清クレアチニン、死亡、入院、および関節破壊に起因する障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｄｕｅ ｔｏ ｊｏｉｎｔ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）が挙げられる）に関するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｆｏｒ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ基準（Ａｒｎｅｔｔら，３１ Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３１５−２４（１９８８）を参照のこと）のうちのいずれかに対応する。さらに、もしくは代わりに、疾患基準は、薬物治療への応答および副作用の存在もしくは非存在、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙによって例示される改善の尺度「２０％」および「５０％」応答／改善率に対応する。Ｆｅｌｓｏｎら，３８ Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．５３１−３７（１９９５）を参照のこと。本発明のＴｈ１７マーカーは、発赤（関節疼痛もしくは他の疼痛に付随する疾患の急性の悪化）、薬物処置への応答、および副作用の可能性を含む疾患進行を同定し、モニターし、そして予測する。]
[0090] 結論として、ＴＨ１７細胞は、炎症および自己免疫疾患の強力な誘導因子である。ＴＨ１７細胞は、多くの自己免疫疾患の標的器官において見いだされている。しかし、本発明までは、これら細胞の表面上の既知のマーカーがないことで、組織から生きているＴＨ１７細胞を検出および単離すること、従って、自己免疫疾患の間のそれらのエフェクター機能の特徴付けは可能でなかった。ＴＨ１７細胞の表面で特異的に発現される分子（例えば、ＢＬＴ１およびポドプラニン）の同定は、これら細胞に関する基本的な研究、およびＴｈ１７関連の病気（例えば、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよびクローン病）の診断に大きく促進する。]
[0091] 以下の実施例は、本発明の処置方法における組成物についての種々の方法を例示する。実施例は、例示であることが意図されるが、本発明の範囲を限定するとは決して意図されない。]
[0092] （実施例１． ＴＨ１７分化、材料および方法）
細胞ソーティング：ＰＢＭＣを、健康な被験体の末梢血から、もしくは施設のＩＲＢプロトコルに従って、臍帯血（全細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ））から得た。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、ネガティブ選択によってその後に単離した。ナイーブ（ＣＤ２５− ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡｈｉ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞および中心的記憶（ＣＤ２５− ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４５ＲＡ−）ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、以下の抗体：ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ２５−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色することによって得、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）でソートした。]
[0093] 分化アッセイ：ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞もしくは中心的記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、無血清Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびサイトカイン（ＩＬ−６、２５ｎｇ／ｍｌ；ＴＧＦ−β、５ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−１β、１２．５ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−２１、２５ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−２３、２５ｎｇ／ｍｌ）中で、７日間の期間にわたって、プレートに結合させた抗ＣＤ３および可溶性ＣＤ２８モノクローナル抗体（各々１μｇ／ｍｌ）で刺激し、その時点で、上清を回収し、ＩＦＮ−β（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはＩＬ−１７Ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）について、対になった抗体を用いてＥＬＩＳＡによって試験した。細胞質内染色を、標準的な方法論および抗ＩＬ−１７−ＡＰＣ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および抗ＩＦＮ−β−ＰＥ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。]
[0094] リアルタイムＰＣＲ：全てのプライマーおよびプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）から得、標準的な方法論に従って使用した。]
[0095] 抗体：ポドプラニンを認識する抗体は、例えば、Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から市販されている。ＬＴＢ４Ｒ１に対する抗体は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から市販されている。上記抗ＢＬＴ１（ＬＴＢ４Ｒ１）：ＦＩＴＣ結合体化ｍＡｂ（２０２／７Ｂ１）を、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から得た。Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎら．（２０００）２７９ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．５２０−２５（２０００）を参照のこと。ＦＡＣＳ染色において使用される上記抗ポドプラニン抗体は、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手したラットモノクローナル８Ｆ１１であった。Ｗａｔａｎａｂｅら，４８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４１１-１６（１９８８）を参照のこと。インビボ注射に使用される上記抗ポドプラニン抗体は、８．１．１．と称され、Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ（ＩｏｗａＣｉｔｙ，ＩＡ）から入手した。Ｆａｒｒら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９９２）；Ｆａｒｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）を参照のこと。]
[0096] （実施例２．ＢＬＴ１発現は、ＴＨ１７細胞において特異的にアップレギュレートされる）
ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）（アラキドン酸の分解生成物であり、炎症の部位において急激に生成される強力な脂質炎症性メディエーターである）は、サイトゾルホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）、およびＬＴＡ４ヒドロラーゼの一連の作用によって、膜リン脂質から得られる。Ｊａｌａ ＆ Ｈａｒｉｂａｂｕ，２５ ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ．３１５−２２（２００４）。ＬＴＢ４は、内皮への白血球の接着および凝集を引き起こし、炎症部位へと顆粒球およびマクロファージを補充する、強力な化学誘引物質である。近年の研究は、ＬＴＢ４が、Ｔ細胞についての化学誘引物質としても機能し得ることを示した。Ｇｏｏｄａｒｚｉら，４ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６５−７３（２００３）；Ｔａｇｅｒら，４ Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８２−９０（２００３）；Ｔａｇｅｒ ＆ Ｌｕｓｔｅｒ，６９ Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，Ｌｕｅｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ １２３−３４（２００３）；Ｍｅｄｏｆｆら，２０２ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９７−１１０（２００５）；Ｍｉｙａｈａｒａら，１７４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９７９−８５（２００５）；Ｍｉｙａｈａｒａら，１７２ Ａｍ．Ｊ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６１−７０（２００５）。]
[0097] 遺伝子発現プロフィール作成データは、ＢＬＴ１が、ＩＬ−６とＴＧＦ−βとの組み合わせによって選択的に誘導され、この組み合わせはまた、ＩＬ−１７を誘導し（図７）、ＴＨ１７細胞の生成をもたらすことを示した。ＢＬＴ１の発現がまた、ヒトＴＨ１７細胞において観察され得るか否かを決定するために、健康なドナーから採取され、かつＩＬ−２１とＴＧＦ−βとの組み合わせ（これは、ヒト細胞においてＴＨ１７細胞の分化を誘導する）の存在下で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化したナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＢＬＴ１特異的抗体でＢＬＴ１の表面発現について分析した。Ｔｈ１７分化のサイトカインの非存在下で、Ｔ細胞のうちの５％のみが、ＢＬＴ１を発現した（図８）。しかし、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞が、ＩＬ−２１＋ＴＧＦ−βの存在下で分化した場合、上記ＣＤ４＋ Ｔ細胞のうちのいくらかは、ＢＬＴ１を発現した。このことは、ＢＬＴ１ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方が、マウスおよび同様にヒトのＴＨ１７細胞上で急激にかつ特異的に発現されることを初めて示す。ＴＨ１７細胞上でのこの選択的発現が、ＢＬＴ１に制限され得：ＢＬＴ２の発現が、ＴＨ１７細胞上で認められなかったが、Ｔｈ２細胞上で認められたことが注意され得る。] 図７ 図８
[0098] （実施例３．ポドプラニン発現は、ＴＨ１７細胞において特異的にアップレギュレートされる）
ポドプラニン（ＰＤＰ）は、Ｔｈ１７細胞上で特異的に同定される別の表面分子である。ポドプラニンは、膜貫通ムチン含有分子であり、これは、病的条件下でリンパ内皮および腫瘍細胞上で発現される。２２，２３．Ｋａｎｅｋｏら，３７８ Ｇｅｎｅ，５２−７（２００６）；Ｗｉｃｋｉ ＆ Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，９６ Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９６，１−５（２００７）。これまで、ＰＤＰの発現は、造血細胞に関して記載されてこなかった。２３． Ｗｉｃｋｉ ＆ Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ， ２００７。これは、ＰＤＰが、いくつかのＴ細胞上で発現され、より特異的に、分化している最中のＴＨ１７細胞上で発現されることを示す最初の研究である（図１０）。] 図１０
[0099] 重要なことには、ポドプラニンは、Ｔｈ１７特異的マーカーを構成し、なぜなら、その発現は、Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ２細胞において認められなかったからである（図１１）。従って、これは、Ｔ細胞の最小限の操作で、ＴＨ１７細胞を単離し、識別することために、特異的マーカーを提供する。] 図１１
[0100] ＴＨ１７細胞に加えて、ＥＡＥを有するマウスの中枢神経系（ＣＮＳ）に由来するマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋細胞）は、ＩＬ−１７を生成できた（図１２）。この集団上でのポドプラニンの発現の分析は、この集団がポドプラニンを同様に発現したことを明らかにした。対照的に、ミクログリア細胞は、ＩＬ−１７もしくはポドプラニンのいずれの顕著なレベルをも発現しなかった。従って、ポドプラニン発現が、ＴＨ１７細胞およびマクロファージの両方におけるＩＬ−１７発現を模倣するようであり、このことは、ポドプラニン発現が、病原性Ｔｈ細胞（ＴＨ１７細胞）のサブセット、および同様に、ＩＬ−１７を生成する病原性マクロファージのサブセットの追跡を可能にし得ることを示す。] 図１２
[0101] （実施例４．ＢＬＴ１は、Ｔｈ１７機能を調節する）
ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）（これは、アラキドン酸の分解生成物であり、炎症の部位において急激に生成される強力な脂質炎症性メディエーターである）は、サイトゾルホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）、およびＬＴＡ４ヒドロラーゼの一連の作用によって、膜リン脂質から得られる。Ｊａｌａ ＆ Ｈａｒｉｂａｂｕ，２５ ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ ３１５−２２（２００４）。ＬＴＢ４は、内皮への白血球の接着および凝集を引き起こし、炎症部位へと顆粒球およびマクロファージを補充する、強力な化学誘引物質である。近年の研究は、ＬＴＢ４が、Ｔ細胞についての化学誘引物質としても機能し得ることを示した。Ｇｏｏｄａｒｚｉら，４ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６５−７３（２００３）；Ｔａｇｅｒら，４ Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８２−９０（２００３）；Ｔａｇｅｒ ＆ Ｌｕｓｔｅｒ，６９ Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，Ｌｕｅｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ １２３−３４（２００３）；Ｍｅｄｏｆｆら，２０２ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９７−１１０（２００５）；Ｍｉｙａｈａｒａら，１７４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９７９−８５（２００５）；Ｍｉｙａｈａｒａら，１７２ Ａｍ．Ｊ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６１−７０（２００５）。]
[0102] ＬＴＢ４は、炎症部位において種々の細胞タイプの補充に関与しているので、ＬＴＢ４の発現がＴＨ１７細胞の選択的移動を誘導し得るか否かを、そのレセプターであるＢＬＴ１を操作することによって調査した。実際に、ＬＴＢ４は、新たに分化したＴＨ１７細胞の選択的移動を誘導したが、Ｔｈ１細胞では誘導しなかった（図３）。] 図３
[0103] より具体的には、ＬＴＢ４の２つのＧタンパク質連結した７回膜貫通ドメインレセプターが、同定されかつ特徴付けされた。Ｔａｇｅｒ ＆ Ｌｕｓｔｅｒ，２００３。ＢＬＴ１（ＬＴＢＲ１ともいわれる）は、ＬＴＢ４に対して特異的な高親和性レセプターであり、主に白血球で発現されるのに対して、ＢＬＴ２（ＬＴＢＲ２）は、より遍在して発現される低い親和性レセプターである。同書。Ｕ−７５３０２、６−（６−（３Ｒ−ヒドロキシ−１Ｅ，５Ｚ−ウンデカジエン−１−イル）−２−ピリジニル）−１，５Ｓ−ヘキサンジオールは、合成物であり、ＢＬＴ１を特異的に結合する。Ｒｉｃｈａｒｄｓら，１４０ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１７１２−１６（１９８９）。Ｕ−７５３０２は、例えば、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））から市販されている。ＬＴＢ４のアンタゴニストとしてＵ７５３０２を使用すると、ＬＴＢ４が、Ｔｈ１７細胞の選択的移動を誘導し、これは、上記ＬＴＢ４アンタゴニストであるＵ−７５３０２の種々の用量の添加によって用量依存様式でブロックされ得る（図 ３）ことが示された。]
[0104] さらに、ＴＨ１７細胞上でのＢＬＴ１の発現はまた、本明細書で示されるように、ＴＨ１７細胞の機能をインビボで調節する。これは、多発性硬化症の実験モデルである実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発症に対するＢＬＴ１除去の効果を試験することによって決定した。ここでＴＨ１７細胞は、重要な病原的な役割を果たしていることが示された。それを示すために、ＢＬＴ１ノックアウト（ＢＬＴ１ ＫＯ）マウスおよび野生型マウスを、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）ペプチド配列ＭＯＧ３５−５５（脳炎誘発性ペプチド）で免疫し、百日咳毒素とともに注射した。ＩＡＣＵＣプロトコルに従って、マウスを維持した。上記ＭＯＧ３５−５５／百日咳毒素プロトコルは、野生型動物において重篤な麻痺の発症を生じた（図４）。対照的に、上記ミエリン抗原ＭＯＧＧ３５−５５で免疫したＢＬＴ１ＫＯマウスは、上記野生型マウスと比較して、それほど重篤な疾患を発症しなかった。このことは、ＢＬＴ１の欠如が、ＥＡＥの発症を低下させたことを示す。さらに、ＢＬＴ１（ＬＴＢ４Ｒ１）欠損マウスは、それらの野生型同腹仔よりもＥＡＥの発症に対して耐性があった。まとめると、これらデータは、Ｔｈ１７細胞を選択的に追跡することに加えて、ＢＬＴ１発現は、ＴＨ１７細胞の機能をインビボで調節することを示す。] 図４
[0105] （実施例５．ポドプラニンは、Ｔｈ１７機能を調節する）
ポドプラニンは、ＴＨ１７細胞のマーカーとして同定され、多発性硬化症の動物モデル（ＥＡＥ）の進行におけるその役割を、本明細書で探査した。抗ポドプラニン特異的抗体（Ｆａｒｒら，１７６ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７７−８２（１９９２））を、ＥＡＥに耐えているマウスにインビボで注射した。コントロール抗体を受容したマウスは、重篤な疾患を発症し、麻痺したが、上記抗ポドプラニン特異的抗体を受容したマウスは、それほど重篤な疾患を発症させなかった。このことは、上記抗ポドプラニン抗体が、自己免疫疾患の進行を阻害したことを示す。従って、これらデータは、抗ポドプラニン抗体の注射が、ＴＨ１７細胞、およびおそらくＩＬ−１７生成マクロファージの病原性活性をブロックし、従って、多発性硬化症の動物モデル（ＥＡＥ）を使用して本明細書で例示されるように、自己免疫疾患の進行を制限するために使用され得ることを示す。図５を参照のこと。] 図５
実施例

[0106] ポドプラニンは、腫瘍細胞の移動および侵襲性において重要な役割を果たすことが以前示された。Ｗｉｃｋｉ ＆ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｏｒｉ，９６ Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１−５（２００７）。ポドプラニンは、ＴＨ１７細胞およびＩＬ−１７生成マクロファージにおいて特異的に発現された。さらに、抗ポドプラニン抗体の注射は、ＥＡＥの重篤度を低下させた。まとめると、これらデータは、ポドプラニンが、病原性Ｔｈ１７細胞およびおそらくＩＬ−１７生成マクロファージの移動を調節し得ることを示す。ポドプラニンがＴＨ１７細胞の移動にどのように関与しているかを決定することは、自己免疫の状況におけるポドプラニンの中和が、ＭＳ攻撃の間にＣＮＳにおいてＴｈ１７細胞のさらなる移動を予防し得、再発性の軽減している疾患（ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）を改善するので、自己免疫の処置に非常に関連性がある。]

权利要求:

請求項1
ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の集団からヒトＴＨ１７細胞の分化を増大させる方法であって、該方法は、該細胞と、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１とを、ＴＨ１７細胞分化を増大させるために十分な量において接触させる工程を包含する、方法。
請求項2
ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−１７の発現のレベルを調節する方法であって、該方法は、該細胞と、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１とを、ＩＬ−１７発現を増大させるために十分な量において接触させる工程を包含する、方法。
請求項3
ＴＨ１７細胞活性および／もしくはＴＨ１７細胞数を増大させるための方法であって、該方法は、細胞もしくは細胞集団と、ＴＧＦ−βアゴニストおよびＩＬ−２１アゴニストとを、該細胞もしくは細胞集団の、ＴＨ１７細胞への分化を増大させ、それによって、ＴＨ１７細胞活性および／もしくは細胞数を増大させるために十分な量において接触させる工程を包含する、方法。
請求項4
前記接触させる工程の前に、ＴＨ１７分化が所望される細胞もしくは細胞集団を同定する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
請求項5
前記細胞もしくは細胞集団は、Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団である、請求項４に記載の方法。
請求項6
ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団への、前駆Ｔ細胞もしくは前駆Ｔ細胞集団の分化を阻害するための方法であって、該方法は、該Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団と、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストとを、もしくはＴＧＦ−βＲおよびＩＬ−２１Ｒとを、ＴＨ１７細胞分化を阻害するために十分な量において接触させる工程を包含する、方法。
請求項7
Ｔ細胞もしくはＴＨ１７細胞、またはこれらの細胞集団におけるＩＬ−１７の活性、発現、分泌もしくはプロセシングのうちの１つ以上を調節するための方法であって、該方法は、ＩＬ−１７の活性もしくはレベルの調節が所望される細胞を同定する工程、および該細胞もしくは細胞集団と、該細胞もしくは細胞集団におけるＩＬ−１７の活性もしくはレベルを調節するのに十分な量のＴＧＦ−β／ＩＬ−２１モジュレーターとを接触させる工程を包含する、方法。
請求項8
前記調節は、ＩＬ−１７の活性、発現、分泌もしくはプロセシングにおける増大を含み、前記モジュレーターは、ＴＧＦ−βのアゴニストおよびＩＬ−２１のアゴニストを含む、請求項７に記載の方法。
請求項9
前記調節は、ＩＬ−１７の活性、発現、分泌もしくはプロセシングにおける減少を含み、前記モジュレーターは、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストを含む、請求項７に記載の方法。
請求項10
ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団の活性を調節するための方法であって、該方法は、該細胞または集団と、Ｔｈ１７細胞もしくはＴｈ１７細胞集団の活性を調節するのに十分な量のＴｈ１７活性モジュレーターとを接触させる工程を包含する、方法。
請求項11
前記モジュレーターは、ポドプラニンアンタゴニストもしくはＢＬＴ１アンタゴニストを含む、請求項１０に記載の方法。
請求項12
生物学的サンプル中のＴｈ１７細胞の存在を検出するための診断試験キットであって、該キットは、ポドプラニンを検出するための手段および／もしくはＢＬＴ１を検出するための手段を含み、ここで該ポドプラニンおよびＢＬＴ１の検出は、該生物学的サンプル中のＴｈ１７細胞の存在を示す、診断試験キット。
請求項13
ＴＨ１７関連自己免疫疾患を診断するための診断試験キットであって、該診断キットは、ポドプラニンのためのプローブおよびＢＬＴ１のためのプローブを含み、ここで該ポドプラニンおよび／もしくはＢＬＴ１の存在は、Ｔｈ１７細胞の存在を同定する、診断試験キット。
請求項14
前記プローブは、固体基材に結合されている、請求項１２または１３に記載のキット。
請求項15
前記固体基材は、イムノブロットを行うための膜である、請求項１４に記載の診断試験キット。
請求項16
Ｔｈ１７関連自己免疫疾患を診断するための診断試験キットであって、該診断試験キットは、生物学的サンプルと、ポドプラニンに結合する抗体とを、該抗体と該生物学的サンプル中に存在するポドプラニン保有Ｔｈ１７細胞との間で抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で接触させるための手段、および該抗体を含む抗体−ポドプラニン複合体を検出するための手段を含み、ここで該抗体−ポドプラニン複合体の形成は、被験体のＴｈ１７関連自己免疫疾患を示す、診断試験キット。
請求項17
ＴＨ１７関連自己免疫疾患を診断するための診断試験キットであって、該診断試験キットは、生物学的サンプルと、ＢＬＴ１に結合する抗体とを、該抗体と該生物学的サンプル中に存在するＢＬＴ１保有Ｔｈ１７細胞との間で抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で接触させるための手段、および該抗体を含む抗体−ＢＬＴ１複合体を検出するための手段を含み、ここで該抗体−ＢＬＴ１複合体の形成は、被験体のＴＨ１７関連自己免疫疾患を示す、診断試験キット。
請求項18
生物学的サンプル中のＴｈ１７細胞を検出する方法であって、該方法は、該生物学的サンプルと、２つの異なるＴｈ１７特異的表面分子に対して指向される少なくとも２つの異なるプローブとを、該ＴＨ１７特異的表面分子への該プローブの結合に適した条件下で接触させる工程であって、ここで各プローブは、該Ｔｈ１７細胞上の別個の部位と反応性である、工程；および該プローブが、該生物学的サンプル中の該ＴＨ１７特異的表面分子に結合するか否かを、フローサイトメトリーによって検出する工程であって、ここで該プローブが該ＴＨ１７特異的表面分子に結合する場合、Ｔｈ１７細胞の存在が示される、工程、を包含する、方法。
請求項19
前記生物学的サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、細胞サンプル、組織サンプル、骨髄および生検物からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
請求項20
前記プローブは、アレイ上に配置されている、請求項１８に記載の方法。
請求項21
診断試験キットであって、該キットは、少なくとも第１のプローブおよび第２のプローブ；ならびにＴｈ１７特異的表面分子を検出するための手段を含み、ここで該プローブは、該ＴＨ１７特異的表面分子に指向され、各プローブは、Ｔｈ１７細胞上の別個の部位と反応性である、診断試験キット。
請求項22
前記プローブのうちの少なくとも一方は、蛍光色素で標識されている、請求項２１に記載の診断試験キット。
請求項23
前記ＴＨ１７特異的表面分子は、セファロース−ウェスタンブロッティングを介して検出される、請求項２１に記載の診断試験キット。
請求項24
Ｔｈ１７特異的表面マーカーが、ディップ−スティックアッセイを介して検出される、請求項２１に記載の診断試験キット。
請求項25
ＴＨ１７細胞特異的表面マーカーを免疫学的に検出するための成分をさらに含む、請求項２１に記載の診断試験キット。
請求項26
フローサイトメトリー検出のための診断試験キットであって、該キットは、少なくとも第１のプローブおよび第２のプローブ、ならびにＴＨ１７特異的表面分子を検出するための手段を含み、ここで該プローブは、第１および第２の該ＴＨ１７特異的表面分子に対して指向され、ここで該ＴＨ１７特異的表面分子は、Ｔｈ１７細胞上で特異的にアップレギュレートされている、診断試験キット。
請求項27
前記プローブのうちの少なくとも一方は、ビーズで標識されている、請求項２６に記載の診断試験キット。
請求項28
診断試験キットであって、該キットは、セファロース−ウェスタンブロッティング手順を行って、ＴＨ１７特異的表面分子を免疫学的に検出するための手段を含み、該手段は、異なるＴＨ１７特異的表面分子に対して指向される少なくとも１つの異なるプローブを含み、該プローブは、Ｔｈ１７細胞上の別個の部位と反応性である、診断試験キット。
請求項29
診断キットであって、該キットは、ディップ−スティックアッセイを行って、ＴＨ１７特異的表面分子を免疫学的に検出するための手段を含み、該手段は、異なるＴＨ１７特異的表面分子に対して指向される少なくとも２つの異なるプローブを含み、各プローブは、Ｔｈ１７細胞上の別個の部位と反応性である、診断キット。
請求項30
生物学的サンプル中のＴｈ１７細胞の存在を検出するための方法であって、該方法は、ポドプラニンもしくはＢＬＴ１のいずれかをコードする核酸の存在を検出する工程を包含する、方法。
請求項31
（ａ）ポドプラニンコード標的ポリヌクレオチドもしくはＢＬＴ１コード標的ポリヌクレオチドまたはこれらのフラグメントのいずれかを含むと推測される生物学的サンプルから、核酸を得る工程；（ｂ）該（ａ）の核酸と、該標的ポドプラニンコードポリヌクレオチドもしくはＢＬＴ１コードコードポリヌクレオチドにおける少なくとも１つの核酸配列を識別し得るオリゴヌクレオチドとを接触させる工程であって、該接触させる工程は、識別的なシグナルを発生させる、工程；（ｃ）該（ｂ）において得られた識別的なシグナルから、ポドプラニンコードポリヌクレオチドもしくはＢＬＴ１コードポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの存在を推測し、従って、該生物学的サンプル中のＴｈ１７細胞の存在を検出する工程、を包含する、請求項３０に記載の方法。
請求項32
被験体における自己免疫疾患を診断する方法であって、該方法は、（ａ）該被験体に由来するサンプル中においてポドプラニンを検出する工程；（ｂ）該被験体に由来するサンプル中においてＢＬＴ１を検出する工程；および（ｃ）ポドプラニンおよびＢＬＴ１の存在もしくはレベルに基づいて、該被験体における自己免疫疾患の存在もしくは重篤度を診断する工程、を包含する、方法。
請求項33
被験体における抗自己免疫疾患治療の効力をモニターする方法であって、該方法は、（ａ）抗自己免疫疾患治療を施された被験体に由来するサンプル中において、ポドプラニンを検出する工程；（ｂ）該被験体に由来するサンプル中においてＢＬＴ１を検出する工程；および（ｃ）ポドプラニンもしくはＢＬＴ１の存在もしくはレベルに基づいて、該被験体における自己免疫疾患の存在もしくは重篤度を検出し、それによって、抗自己免疫疾患治療の効力をモニターする工程、を包含する、方法。
請求項34
被験体における自己免疫疾患もしくは慢性炎症性疾患を診断するかもしくはモニターする方法であって、該方法は、該被験体におけるＴＨ１７細胞の存在を検出して、該被験体における該自己免疫疾患もしくは慢性炎症性疾患を診断もしくはモニターする工程を包含し、ここで該Ｔｈ１７細胞は、ポドプラニンおよびＢＬＴ１を特異的にアップレギュレートする、方法。
請求項35
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の集団から、ヒトＴＨ１７細胞の分化を増大させるための、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１の使用。
請求項36
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の集団から、ヒトＴＨ１７細胞の分化を増大させるための、ＴＧＢ−βのアゴニストおよびＩＬ−２１のアゴニストの使用。
請求項37
ＴＨ１７細胞もしくはＴＨ１７細胞集団への、Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団の分化を阻害するための、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストの使用。
請求項38
Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団におけるＩＬ−１７の発現、活性、分泌もしくはプロセシングを増大させるための、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２１もしくはこれらのアゴニストの使用。
請求項39
Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団におけるＩＬ−１７の発現、活性、分泌もしくはプロセシングを低下させるための、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストの使用。
請求項40
ＴＨ１７細胞活性によって影響を与えるもしくは媒介される障害の処置のための医薬の調製における、ＴＧＦ−βのアンタゴニストおよびＩＬ−２１のアンタゴニストの使用。